Klinikai Fiziológiai Tanszék

DEBRECENI EGYETEM Általános Orvostudományi Kar

Biokémiai- és Molekuláris Biológiai Laboratórium

RAAS enzimjeinek vizsgálata

RAAS enzimjeinek vizsgálata

Munkacsoportunk egy része a RAAS rendszerben aktív szerepet játszó enzimeket vizsgálja. A RAAS rendszerben résztvevő enzimek aktivitásának illetve mennyiségének meghatározásához a BMG által kifejlesztett NovoStar platereadert használjuk, ami képes abszorbancia, lumineszcencia és fluoreszcencia mérésére is. Mikroplate reader révén 384 well plateig nem jelent gondot a meghatározás. A beépített pipettorral a reagens plateből a mérő platebe pipettázható az oldat. Egy reagens injektor is megkönnyíti a dolgunkat, a változtatható inkubációs lehetőségeknek köszönhetően pedig élő sejtes meghatározások is zavartalanul kivitelezhetők.

Laborunkban végzett standard mérések közé tartozik az ACE és ACE2 aktivitás valamint ACE mennyiség meghatározás.
Az ACE aktivitás mérés alapja egy FAPGG-nek nevezett optikailag aktív szubsztrát, melyet az ACE képes bontani, a keletkezett 2 termék pedig már optikailag inaktív, így a mérés során az optikai denzitás csökkenését tapasztaljuk, ez pedig arányos a mért oldatban lévő ACE aktivitásával.
ACE2 enzim aktivitásának méréséhez egy kettős fluoreszcens festékkel jelölt tripeptidet használunk. Ameddig a két festék közel van egymáshoz, hiába gerjesztjük az MCA komponenst, mert az energiáját átadva nem emittál rá jellemző hullámhosszúságú fényt. De amikor az ACE2 hasítja a tripeptidet, a keletkezett termékek messze kerülnek egymástól így az MCA komponenst gerjesztve a rá jellemző fényt detektálhatjuk. A módszer specificitását DX-600-as ACE2 inhibitorral teszteltük, ami az ACE2 aktivitást 0-ra csökkenti. Ezzel a módszerrel jutottunk arra a következtetése, hogy amikor a szív szisztolés pumpafunkciója azaz az ejekciós frakció csökken, a szérumban megnő az ACE2 aktivitása.
Nemcsak az ACE aktivitását, hanem az enzim mennyiségét is meg tudjuk határozni szendvics ELISA módszerrel. Ennek elméleti háttere az, hogy az ELISA plate aljára kötött capture antitestet vagy szövetpreparátumban lévő ACE enzimet kikötjük, majd ehhez detekciós antitestet adunk, a rajta lévő peroxidáz a kromogén szubsztrátot bontva színes terméket ad, a szín intenzitása pedig arányos az ACE mennyiséggel. Azért, hogy kvantifikáljuk az értékeket, minden esetben kalibrációs görbét veszünk fel rekombináns enzim segítségével.
TITIN fehérje biokémiai vizsgálata

TITIN fehérje biokémiai vizsgálata

A titin fehérje a szarkomer legnagyobb fehérjéje, molekuláris rugóként működve felelős a szívizomsejt passzív erejének kialakításáért. Humán szívizomban 2 izoformája található meg, A rövidebb, és rigidebb 3 MDa súlyú N2B, valamint a hosszabb, rugalmasabb, 3,3 MDa-os N2BA. Az N2BA, valamint N2B izoformák megoszlása egészséges, felnőtt, humán szívizomban 30 és 70%-ra tehető. Ezen arány megváltozása, illetve poszttranszlációs módosítások hatással lehetnek a szarkomer elasztikus tulajdonságaira. A titin fehérje merevségének növekedése diasztolés diszfunkció kialakulásához vezethet.

Az óriásfehérje foszforiláltsági állapotának és izoforma megoszlási arányának biokémiai vizsgálatára alkalmas gélelektroforézis meghonosítását, valamint a titin SH-oxidációjának és karbonilációs állapotának tanulmányozására beállított Western-blot alapú módszer kidolgozását követően módunkban áll feltérképezni ezen biokémiai módosítások szerepét különböző, a szívizomsejteket érintő patológiás állapotokban humán és rágcsáló modellek esetében.

A MEDIA (Metabolic Road to Diastolic Heart Failure) nemzetközi együttműködés keretein belül laborunkban a titin fehérje oxidációs és karbonilatív károsodásának vizsgálata zajlik a diasztolés szívelégtelenség állatmodelljében.
Asymmetric flow field-flow fractioner

Asymmetric flow field-flow fractioner

Jelentősebb közlemények

Borbély A, Falcao-Pires I, van Heerebeek L, Hamdani N, Edes I, Gavina C, Leite-Moreira AF, Bronzwaer JG, Papp Z, van der Velden J, Stienen GJ, Paulus WJ
Hypophosphorylation of the Stiff N2B titin isoform raises cardiomyocyte resting tension in failing human myocardium
Circ Res. 2009 Mar 27;104(6):780-6. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.108.193326. Epub 2009 Jan 29, PubMed link

Hírek

Kutatási eredményeiket ismertették
2018 május 24. 14:09 (csütörtök)
Közösen a vegyészmérnök képzésért
2018 május 24. 10:47 (csütörtök)
Lendületben
2018 május 22. 09:47 (kedd)
Célegyenesben
2018 május 18. 09:22 (péntek)
Jótékony hallgatók
2018 május 17. 13:31 (csütörtök)